微/纳流控细胞分析学术报告会 点击进入>>

English

技术经验

您当前的位置是:首页 - 技术经验
日立LaChrom Ultra超高速液相色谱仪操作规程

一、准备工作

1)根据各药品规定的配制方法,配制各种单项溶液,用微孔滤膜(0.45μm)单向抽滤。纯化水系溶液用水膜过滤,有机溶剂(或混合溶剂)用油膜过滤。 

2)脱气:配好的流动相需要洗脱排气泡。方法:用超声波清洗器清洗排气泡,时间约10-20分钟。

二、开、关机

1)打开组织器(最上面模块)的电源开关,按泵、进样器、柱温箱、检测器的顺序打开开关,待各部分分别显示初始化完毕后,最后打开EZChrom Elite化学工作站。

2)关机时,首先退出EZChrom Elite化学工作站,按与开机时相反的顺序关闭系统的其他部分。

三、冲洗、检查

1、冲洗溶剂瓶到泵之间的管路

目的是排出这一段管路里的气泡及可能的污染物。

1)逆时针旋转Drain Valve阀180度,打开该阀门(下面模块左侧圆形阀门),以Purge(冲洗)系统。

2)从“Control”下拉菜单中选择“Instrument Status”,点击“Pump”下的“Manual Set” 按钮,“Flow Rate”设置范围为0-5mL/min,冲洗流路一般为2-3mL/min,改变B溶剂的百分比例,可以选择使用的冲洗溶剂,可以单独使用A瓶溶剂(乙腈、甲醇)或B瓶溶剂(水),也可以使用A和B混合溶剂进行冲洗,点击OK,冲洗开始,冲洗时间一般5分钟左右,直到管线内(由溶剂瓶到泵入口)无气泡为止。

3)冲洗完毕,点击“Turn Off”,弹出对话框,点击“OK”,停止流路冲洗。

4)顺时针旋转,关闭Drain Valve阀,完成冲洗程序。

2、冲洗自动进样器

清洗包括:注射器/柱塞杆(Syringe Purge/Plunger),洗涤槽排水口(Wash Port)。

1)从“Control”下拉菜单中选择“Instrument Status”,点击“Sampler”

2)点击“Syringe Purge/Plunger Wash”,输入范围在0-5000uL的清洗溶剂体积。该仪器自动进样器为100uL,清洗溶剂体积选择500uL,则柱塞杆运动5次,清洗5次。

3)点击“OK”,提示将进样六通阀上的5号位的密封螺丝去掉,或者安装一个活塞清洗器,点击“OK”,开始清洗柱塞杆。

4)点击“Flush Wash Port”,“Wash Port Wash Strokes”设定清洗次数,如3次,则柱塞杆运动3次。点击“Wash”,开始清洗。注意,此时六通阀上的5号位有溶剂流出。

3、冲洗泵

有一段时间没用,或者换了新的流动相,需要先冲洗泵和进样阀。

1)从“Control”下拉菜单中选择“Instrument Status”,点击“Pump”,设定冲洗泵的溶剂、流速。

2)从“Control”下拉菜单中点击 “Preview Run”,图中显示泵A的压力变化曲线。

3)点击红色圆点图标(stop run),停止冲洗。

4)在“Pump”窗口里点击“Turn off”,或直接在L-2160U PUMP面板上按PUMP ON/OFF,停泵。

4、检查检测器基线

1)从“Control”下拉菜单中点击“Baseline Check”。 根据检测器指标 (在打开电源至少两小时以后测试):Noise: 0.6×10-5AU or less;Drift: 1.0×10-4AU/h or less,设定监测时间和指标值(缺省为15min;Noise:50;Drift:5000)。Noise的单位为mAU,因此是0.006mAU。

2)点击“Submit”后,仪器先进入方法平衡,当窗口下方显示: ,表明基线监测在进行中。

3)在停止监测后,会弹出基线监测结果窗口。

四、调用或建立仪器运行方法 “Method”

1)如果调用已建好的方法,从“File”下拉菜单中选择“Method”,单击“Open”。 选择后缀名为met的方法文件,单击“Open”,完成方法的调用。在此方法基础上,可按照后面新建方法的步骤来修改各项设置。

2)如果需要新建一个方法,从“File”下拉菜单中选择“Method”,单击“Method” 右拉菜单中的“New”。在方法中,经常需要调整的测量方法部分:流动相比例、柱温、采集时间等。

单击“Aux Traces”菜单,使其命令前有“√”标志,来设定所需追踪记录的仪器参数(温度、环境温度、A泵的压力)。

单击“Baseline Check”菜单,设定基线测试的标准值。

单击“Trigger”菜单选择触发方式。对于本仪器,固定采用“External”方式。

仪器设置完成,点击“Control”下拉菜单中的“Download Method”,将设置的方法传送到LC仪器中。

方法设定完成后,从“File”下拉菜单中选择“Method”,单击“Method” 右拉菜单中的“Save As”,在“File Name”一栏输入方法的名称,然后点击“Save” 按钮,完成方法的存储。

五、进样分析

1)预进样(Preview Run),

选择“Control”下拉菜单中的“Preview Run”,自动进样器不取样,检测器采集流动相的信号。观察基线平稳后,点击图标 ,或从“Control”下拉菜单中的“Stop Run”,停止预进样。

2)单次进样(Single Run)

可在预进样进行的同时,选择“Control”下拉菜单中的“Single Run”,或点击图标  ,输入样品号(Sample ID)、选择方法(Method)、数据文件存储路径(Data path)、输入数据文件名(Data file);输入样品瓶在自动进样器中的位置号(Vial)、进样体积(Injection volume),如果前面的预进样程序在进行中,则右上角为“Submit”,点击“Submit”,提交,“Single Run”进入排队状态,在“Preview Run”停止后,自动执行“Single Run”;如Preview Run已完成,则右上角为“Start”,点击“Start”,开始“Single Run”分析。

3)系列进样(Sequence Run)

当有任务正在执行时,不能在当前联机活动的窗口中进行系列的设置。此时,回到软件打开时的EZChrom Elite窗口,右键点击所选的检测器,在下拉菜单中点击“Open Offline”,打开脱机窗口,进行离线的序列设置。

从“File”下拉菜单中选择“Sequence”,单击“Sequence Wizard”。在“Data File Type”中选中“For acquisition”,则所编序列用于采样操作。

点击“Next”,选择Increment Number作为样品号(Sample ID)、数据文件存储路径(Data path)、输入数据文件名(Data file);输入序列数(Number of unknown runs in sequence),每个序列重复的次数(Repetitions per run)。

点击“Next”,输入样品瓶在自动进样器中的位置号(First Vial)、进样体积(Autosampler injection volume)。

点击“Next”,在序列中设置校正样品,如无,直接点击“Finish”。作进一步修改设置,如在序列结束后关机,则在最后一行选择Run Type为“Shutdown”。 设置完成,存储后缀名为seq的序列文件。

4)调用系列

在联机窗口选择“Control”下拉菜单中的“Sequence Run”,或点击图标 ,选择已编好的系列进样方法,点击“Start”,开始进样分析。

5)传送系列

如上述的4)未能启动操作,则在联机窗口,点击“Control”下拉菜单中的“Download Tab”,将设置的序列方法传送到LC仪器中。

6)分析任务排队(Run Queue)

选择“Control”下拉菜单中的“Run Queue”,或点击图标 ,在下图里点击“Begin Run”右边的时钟图标,弹出“Schedule Run”对话框,选择该任务的执行时间。

7)同时显示多个窗口

选择“Window”下拉菜单中的“Tile Horizontally”,水平平铺当前打开的各个窗口

六、数据处理

1)显示谱图

脱机数据处理,点击“Open Offline”,点击“Login”,点击“OK”。从“File”下拉菜单中选择“Data”,点击“Open”,数据文件的后缀名为dat。

2)多个色谱图显示

在UV吸收图窗口点击鼠标右键,弹出菜单。

●Add Trace: 一次只选择一个色谱图,在当前色谱图上叠加另一个色谱图,用于两个色谱图的比较,如保留指数、峰面积的重现性比较。

操作:Add Trace → Open Data → 选择一个*.dat文件,Open → Apply。

●Add Multiple Traces : 一次可选择多个色谱图,在当前色谱图上叠加多个色谱图,用于多个色谱图的比较。

操作:Add Multiple Traces → Open Data → 左键双击*.dat文件,自动加入Data Files列表中→ Open

●Clear Overlays: 取消谱图叠加,回到当前色谱图。

操作:Clear Overlays → Yes

●Axis Setup: 设置UV吸收图坐标轴X和Y轴的显示尺寸

操作:Axis Setup → 设置 → OK

●Appearance: 设置在谱图的背景色、线的颜色、文字颜色。

●Full Unzoom: 恢复至全图。

3)查看数据的样品信息

为了便于日后查看数据,在测试时,应详细输入样品的信息,如名称、浓度、测试时间。*.dat文件的样品信息描述在Data →Properties→Description。直接在其中输入信息,点击OK后即保存。

4)积分

基本操作: File→Data→Open→*.dat→UV窗口→Analyze→显示积分和基线→用Integration Off选择不要显示积分的区域→Analyze Now→Integration Events。


注意事项

1)根据检品要求调“流速”,未明确“流速”的检品,调流速使柱压在适宜范围内(不得超过40MPa)。 

2)进样前基线要走平稳,且检测器已预热半个小时。

3)含盐的流动相的冲洗方法:每天操作结束后,先用纯化水或含甲醇5%(最高浓度在20%以下)的水冲洗时间约20~30分钟。再用高浓度甲醇(含甲醇85%以上)溶液冲洗,约30~60分钟(注:不能直接用有机溶剂冲洗,盐类易析出,堵塞色谱柱,造成色谱柱永久性损坏;所用水最好是重蒸馏的水。必须抽滤和脱气)。

不含盐的流动相的冲洗方法:每天操作结束后,先用流动相冲洗约10~15分钟,再用含5%甲醇的水冲洗10~20分钟。最后用高浓度甲醇(含甲醇85%以上)溶液或纯甲醇冲洗,时间约20~30分钟(注:不能直接用纯水冲洗,易造成流动停止。所用水最好是重蒸馏的水。必须抽滤和脱气)。

4)流动相或单项溶剂需经过0.45μm的微孔滤膜过滤(色谱纯的有机溶剂可以不用过滤),以降低色谱柱受污染的程度,延长使用寿命。抽滤流动相或单项溶剂时,应注意滤膜的选择:抽滤纯水或纯水溶液时,选用水系滤膜,抽滤分析纯有机溶剂或混合溶液中含有有机溶剂,要选用脂(F)滤膜。

5)若仪器长时间不用,可定期加电,使仪器预热一段时间,以免仪器内部件受潮。

6)在电压不稳定时,连续减压,应随时注意观察压力变化。

7)在通常情况下,真空泵运转工作时,调压旋钮应保持处于旋紧状态。减压运转只在特定情况下(如固相萃取操作)使用。

8)每次使用完毕后,首先清洁工作台面,将样品、各种玻璃器皿,资料等整理干净。

登记仪器使用情况!

(供稿者:张尧)